Він став ревним учнем і постійним супутником апостола Павла, який називав його своїм улюбленим сином. У 65 році Павел висвятив Тимофія на єпископа Ефеської Церкви, яку той очолював близько 15 років.

Святий Тимофій прийняв мученицьку смерть в Ефесі, коли намагався зупинити язичницьке святкування на честь ідолів. Розгнівані язичники побили його камінням.